Озонова діра, Детальна інформація

Незабаром був ідентифікований сам цей агент. У 1985 р. у співробітництві з Подаком і Г. Хенгартнером з лікарні Цюрихського університету ми знайшли білок, що у присутності іонів кальцію викликала такі ж ушкодження клітинної мембрани, як і живі кілерні клітки чи виділені з них гранули. Цей білок ми одержали в чистому виді, пропустивши екстракт гранул через хроматографічні стовпчики (де білки розділялися в залежності від електричного заряду і молекулярної маси) і перевіривши кожну фракцію на здатність викликати лізис еритроцитів, тобто ушкодження зовнішньої мембрани, у результаті якого клітки набухають і лопаються. Незалежно білок-«убивцю» виділили Д. Мессоні і Ю. Чопп з Університету в Лозанні. За здатність утворювати пори він названий перфоріном.

До цього часу в гранулах цитотоксичних Т-лімфоцитів і NK-кліток виявлений тільки один утворюючий пори білок – цей самий перфорін. Його молекулярна маса 70 тис. дальтонів. Якщо клітки інкубують з перфоріном у присутності іонів кальцію, вони через кілька хвилин лізуються. Однак якщо іони кальцію додати до перфоріну до того, як він зв'яжеться з клітками, то білок зовсім не виявляє свою лізуючу здатність. Цей парадоксальний на перший погляд факт багато чого проясняє в механізмі дії перфоріна на клітки.

Кілерна клітка виділяє молекули перфоріна, і ці молекули вбудовуються в мембрану клітки-мішені. Там вони полімеризуються, тобто з'єднуються один з одним. Полімеризація відбувається тільки в присутності іонів кальцію. Полімер, що утвориться, може приймати різні конфігурації, але в оптимальних умовах кінцевий продукт полімеризації має форму циліндра. При електронній мікроскопії він виглядає як кільце, якщо орієнтований уздовж пучка електронів, і як дві рівнобіжних лінії – якщо поперек. Внутрішній діаметр циліндра, за даними Подака і Деннерта, варіює від 5 до 20 нм.

Щоб перфорін зашкодив клітку-мішень, його полімеризація повинна відбуватися усередині мембрани, тому що впровадитися в мембрану можуть тільки мономери перфоріну. Якщо полімеризація відбудеться в розчині, то полімер не зможе проникнути потім у мембрану й убити клітку. Зміст цього зрозумілий: виявившись у позаклітинному просторі чи кровотоці, де в надлишку мається кальцій, перфорін швидко полімеризуеться і стає неактивним, що виключає можливість випадкового ушкодження інших, нормальних кліток організму.

Утворення в клітинній мембрані пір у результаті полімеризації перфоріну приводить до швидкого і легко помітного стану клітки. Зовнішня мембрана живої клітки утримує усередині її білки й інші великі молекули (за винятком тих, котрі повинні секретуватись). Крім того, вона забезпечує поділ іонів, так що одні з них концентруються усередині клітки, а інші залишаються ззовні. Унаслідок нерівномірного розподілу позитивно і негативно заряджених іонів існує мембранний електричний потенціал: внутрішній вміст клітки має негативний заряд стосовно позаклітинного середовища. Коли цілісність мембрани порушується, іони і вода перерозподіляються у відповідності зі своїми електрохімічними градієнтами, прагнучи до рівноваги, і мембранний потенціал зникає. Якщо дірки невеликі по розмірах, то виникає так називаний ефект Доннана: великі молекули не можуть вийти з клітки, тому що дірки для них малі, а вода і солі з навколишнього розчину проникають через мембрану усередину. В результаті клітка набухає і зрештою лопається.

За допомогою введених у клітку-мішень мікроелектродів нам вдалося зареєструвати значне падіння мембранного потенціалу незабаром після додавання перфоріну. Чуттєве електронне устаткування дозволило навіть вимірити потік іонів, що проходить через індивідуальну пору. Отримані результати погоджувалися з пророкуваннями теорії ефекту Доннана. Наші дані, крім того, свідчили, що утворені перфоріном пори – це стабільні структури і внутрішній канал пори постійно відкритий. Встановивши, які іони і молекули проходять через ушкоджену перфоріном мембрану, ми оцінили внутрішній діаметр пори. Він виявився в межах 1 – 10 нм, що трохи менше, ніж випливало з електронних мікрофотографій (5 – 20 нм).