Механізми інактивації потенціал - залежних К+ каналів, Детальна інформація

Demo and Yellen показали, що час відновлення від інактивації (тобто час, потрібний для того, щоб канальний білок повернувся від інактивованого стану до закритого неінактивованого стану) скорочується за присутності високих концентрацій К+ в зовнішньому середовищі. Це узгоджується з ідеєю про "пом'якшення інактивації".

Експерименти з ізольованими каналами підтвердили точку зору про те, що канали інактивуються у відкритому стані. Точніше, для того, щоб інактивуватись, канал спочатку має відкритися, а після приєднання, інактиваційна частинка заважає каналові повернутися до закритої конформації. Отже, просту кінетичну модель актиації можна зобразити таким чиом: С-О-І. Для того, щоб перейти від інактивованого до закритого стану, каналові необхідно відкритися. (мал.2) Інактиваційний ShakerB кульковий пептид поводиться як блокатор відкритих каналів.

Стехіометрія інактиваційної реакції.

З вищесказаного випливає очевидність того, що потенціал-залежні канали - це тетрамери, утворені ідентичними чи змішано - незалежними субодиницями. Коли це так, то кожен канал має 4 незалежні NH2 - кінці, потенційно здатні бути інактиваційними частинами. Скільки їх потрібно, щоб відбулася інактивація?

MacKinnon et al. підійшли до цього питання створюючи субодиничні форми Shaker, в яких присутність інктиваційної кульки була пов'язана з мутацією, що робить канал стійким до блокади СТХ, але не має відношення до інактивації. Цю форму каналу ін'єктували в ооцити Xenopus laevis разом з токсин-нечутливими неінактиваційними субодиницями, і очікувалась експресія тетрамерів з хаотичним випадковим складом. Достатньо лише одного токсин-зв'язуючого сайту, щоб підтвердити чутливість до токсину, коли лише однієї кульки достатньо для інактивації каналу, тоді всі токсин-чутливі канали з вбудованими 1-4 токсин чутливими субодиницями, які несуть кульки, мають інактивуватися.

Насправді, всі швидко інактиваційні компоненти, індуковані ін'єкцією змішаних субодиниць, блокувалися СТХ. Однак інактивація каналів, які містили менше ніж 4 інактиваційні частинки, була повільнішою ніж у тих, які містили всі 4 кульки. Такі дані можна трактувати аналогічно до доза-залежного рівня інактивації ShB(6-46 каналів, на які діяли вільним кульковим пептидом, при чому зростання інактиваційного рівня відбувалося коли пептид був більш позитивно зарядженим. В будь-якому разі припускається, що збільшення концентрації кулькового пептиду біля його рецептора, збільшує вірогідність їхнього зв'язку і відтак - рівня інактивації; тим не менш, лише одна кулька взаємодіє з гирлом каналу.

( - субодиниця швидкої інктивації.

Більшість досліджень молекулярного та біофізичного механізмів швидкої інактивації К+ каналів зосереджувалось навколо NH2 кінцевого домену а- субодиниці канального білку. Однак, деякими авторами було також висловлено думку про те, що білкові домени з інших субодиниць можуть спричинювати швидку інактивацію неінактивованих каналів, коли їх експресувати разом з а- субодиницею.

Retting et al. ідентифікували клони цДНК, які кодують 2 ізоформи В- субодиниць К+ каналів мозку щурів. Коекспресія одного з них КVB1 з мРНК, що кодує RCK1 веде до експресії швидко інактивованого струму, на відміну від експесії самого RCK1, який не інактивується. Так само, коекспресія КVB1 і RCK4 прискорює у 8 разів інактивацію експресованого окремо RCK4.

Експериментальна очевидність пітверджує ідею про те, що NH2 кінцева форма КVB1 субодиниці утворює інактиваційну частинку (В-кульку), що поводиться так само, як і ShakerB пептид. КVB1 NH2 кінець має подібну первинну структуру з NH2 кінцем інактиваційних К+ каналів ссавців (і родиною Shaker дрозофіли). Ця подібність включає кластер гідрофобних амінокислот та групу заряджених залишків. Делеція КVB1 NH2 кінця унеможливлює швидку інактивацію при коекспресії з RCK1, а додавання відповідного пептиду всередину клітини, відновлює її.

Як і у випадку з ShakerB пептидом, інактивація за допомогою (-кульки зростає при збільшенні позитивного заряду кульки. Більше того, коекспресія KV(1 з ShB(6–46 веде до виникнення інактиваційних К+ струмів. Виявляється, що (-кулька може повністю повторювати функції раніше описаної NH2 – кінцевої ділянки ( субодиниці. (мал.2, мал.3) Природньо припустити, що обидві “кульки” взаємодіють з одним тим самим сайтом на внутрішньому гирлі каналу, оскільки обидві мають гідрофобний профіль і (- інактивація дестабілізується підвищенням концентрації К+ назовні клітини, що відбувається при класичному N-типові інактивації.

Можливість комбінування різних ізоформ ( чи (- субодиниць в К+ каналах розглядається як спосіб фізіологічної модуляції інактивації К+ каналів in vivo.

С- тип інактивації.

Ми вже розглянули N-тип інактивації, яка відбувається швидко, однак, виявляється, що багато К+ каналів демонструють іншу форму інктивації – повільну.

Робота Hoshi et al. показала, що саме СООН- кінцевий домен бере участь в цьому типові інактивації (інактивації за С-типом). Ця ідея виникла після спостереження того, що альтернативно сплайсовані С-кінцеві варіанти показували різний рівень повільної інактивації. Iverson & Ruby також помітили, що різні С – кінці впливають на стабільність довготривалого інактивованого стану в різних конструктах Shaker. Інші дослідження показали, що С- інактивація відбувається принципово іншим чином, ніж N- інактивація.

Внутрішньоклітинний ТЕА, що конкурує за зв’язування рецептора на внутрішньому гирлі каналу з кульковим пептидом, не впливає на повільну інактивацію. Але зовнішній ТЕА сповільнює С- інактивацію та зменшує макроскопічний струм у ShB(6–46 мутантів. Рівні інактивації мають лінійну залежність від концентрації ТЕА іззовні, і амплітуди струму також пропорційно зменшуються. Цей вплив ТЕА на С- тип інактивації відповідає моделі “нога в дверях”. Оскільки трипсин не виявив ніякого впливу на зовнішній бік каналу при С- інактивації, механізм “кульки й ланцюжка” було виключено. Тоді дослідники висловили припущення, що при С-типові інактивації відбуваються більш значні структурні перебудови з зовнішнього боку мембрани. Хоча деякі експерименти з реєстрацією струмів у дикого типа ShB(6–46 і підтвердили справедливість моделі “foot in the door”, однак інші дослідження показали, що ефекти проникливих йонів на С-тип інактивації не можна розглядати за такою спрощеною схемою.

Наприклад, Lopez-Barneo et al. зробили низку амінокислотних замін в ShakerВ каналах, які не мали N- типу інактивації і виявилося, що найдраматичніші наслідки для інактивації за С- типом мала заміна в Т449К мутанта, коли рівень інактивації зменшувався в 42 рази порівняно з нормальними каналами. Таким чином, амінокислотний залишок в 449 положенні виявляється критичним для визначення рівня інактивації. З іншого боку Lopez-Barneo помітив, що зовнішні катіони на додаток до того, що вони сповільнюють С-тип інактивації, можуть також впливати на кількість каналів, які відкриваються при деполяризації. Цей ефект більше проявлявся у тих мутантів, які характеризувалися більш швидкою С- інактивацією, а саме у Т449А, Т449Е, Т449К. В цих трьох випадках величина пікового струму на стільки залежала від зовнішньої концентрації К+ , що струм зовсім не виникав за відсутності К+ . Pardo та співробітники помітили, що калієвих струмів, індукованих KV1.4 в ооцитах Xenopus зовсім не виникало при заміні зовнішнього К+ на непроникні катіони. Цей ефект опосередкований зниженням кількості каналів, здатних до відкривання.

Подальші тонкощі механізму С-інактивації досліджував Yellen з колегами. Їм вдалося встановити, що С-тип інактивації включає в себе конформаційні зміни в зовнішньому гирлі каналу. Вони показали, що перехід від відкритого до С-інактивованого стану змінює афінність каналу до Cd2+ у 45.000 разів. А саме присутність йонів Cd2+ прискорює перехід каналу до С-інактивованого стану. Yellen запропонував таке пояснення своїх спостережень. Чотири цистеїнові залишки в 449 положенні у відкритому каналі, ймовірно, розташовані далеко один від одного, зважаючи на низьку афінність до зв’язування Cd2+ . Інактивація зводить їх докупи, утворюючи високоафінний центр зв’язування Cd2+ , який стабілізує інактивований стан.

Підсумовуючи обговорення даних по С-інактивації з певністю можна сказати, що це дуже складний процес, який відбувається не лише за допомогою СООН- кінця калієвих каналів, але проходить зі структурними перебудовами канальної структури, або близьких до неї доменів. Графічно процес, який відбувається, можна зобразити як спадання стінок каналу, через який протікає струм за участю катіонів, які впливають на зовнішню частину каналу.

Підсумок.

Та інформація, якою ми володіємо насьогодні дозволяє нам розуміти швидку інактивацію як наслідок міжмолекулярної взаємодії цитоплазматичного N-кінцевого домена з рецептором, розташованим у внутрішньому гирлі каналу. N-кінець сполучається з рештою канальної структури за допомогою ланцюжка. Інактивація за цим типом відбувається внаслідок електростатичної взаємодії між основними залишками кулькового пептиду і кислотними залишками в гирлі каналу лише тоді, коли канал перебуває у відкритому стані. Вихід каналу з інактивації відбувається внаслідок спонтанного вивільнення кулькового пептиду з рецептора.

Відомості про С-тип інактивації досі ще не дуже певні, але більшість даних свідчить про обов’язкові конформаційні зміни із зовнішнього боку канальної структури в процесі такої інактивації.

Використана література.

Kukuljan Manuel, Pedro Labarca and Ramon Latorre. Molecular determinants of ion conduction and inactivation in K+ channels. /Am.J.Physiol.268. C535-556,1995.

Sanguinetti M.C. and Jurkiewicz N.K. Delayed Rectifier Potassium Channels of Cardiac Muscle /Am.J.Physiol.. C120-142,1995.

Karen K.Deal, Sarah K. England. Molecular Physiology of Cardiac Potassium Channels/Physiological reviews,vol 76#1,C49-76,1996.

PAGE

PAGE 2