Характеристика активованої ATPази, Детальна інформація

Уявлення про вузьке розповсюдження Са2+, Mg2+- АТРази були спростовані лише в 1978 році, коли Ді Поло та його співробітники описали АТР-залежний транспорт Са2+ крізь плазматичні мембрани типових збудливих клітин - гігантських аксонів кальмара. За короткий час присутність Са2+, Mg2+- АТРази була доведена для плазматичних мембран багатьох клітин – скелетних, гладеньких м’язів та серцевих м’язів, клітин залозистих тканин, мозку та клітин. За сучасними даними Са2+, Mg2+- АТРаза плазматичних мембран відноситься до числа найбільш широко розповсюджених ферментних систем та є невід’ємним білковим компонентом плазматичної мембрани клітин еукаріот.

Перші найбільш загальні відомості про будову та функції Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран були отримані при дослідженні ферменту у складі нативної мембрани еритроцитів. Однією з найважливіших характеристик АТР-гідролазної системи є механізм гідролізу АТР. За цією ознакою всі відомі АТРази розділяють на два основних типи. АТРази першого типу (F та V-АТРази) здійснюють реакцію гідролізу АТР шляхом прямого переносу \x03B3-фосфату молекули АТР на молекулу води. Ферменти другого типу – Р-АТРази або Е1-Е2-АТРази - під час гідролізу АТР утворюють проміжну фосфорильовану форму ферменту. Вони переносять \x03B3-фосфат молекули АТР на фермент з утворенням ковалентного ацилфосфатного зв’язку з бічною карбоксильною групою амінокислотного залишку білку, а потім шляхом гідролізу цього зв’язку на молекулу води.

Дослідження функціональних властивостей Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран продемонстрували її приналежність до ферментів Е1-Е2 типу. При підвищенні концентрації іонів Са2+ в цитоплазмі відбувається зв’язування катіонів з ферментом, який знаходиться у формі Е1-конформації, що характеризується високою спорідненістю до Са2+. Відбувається Са2+-залежний перенос \x03B3-фосфату молекули АТР на молекулу ферменту та утворення фосфорильованого продукту Е1-Р. На стадії фосфорильованого ферменту відбувається конформаційна перебудова білка у форму Е2-Р. На стадії конформеру Е2-Р спорідненість Са2+, Mg2+- АТРази до іонів Са2+ падає на декілька порядків. Результатом такого конформаційного переходу є вивільнення Са2+ у зовнішньоклітинний простір. Завершується реакційний цикл Mg2+-залежним дефосфорилюванням Са2+, Mg2+- АТРази та перетворенням ферменту у форму Е1 (Рис.1).

Рисунок 1.

Схема реакційного циклу Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран.

Са2+

АТР + Е1 Е1 - Р + АDР

Рі + Е2 Е2 - Р

Са2+

де Е1, Е2 - конформаційні форми ферменту,

Рі - неорганічний фосфат.

Дослідження Са2+, Mg2+- АТРази у складі нативної плазматичної мембрани дозволило отримати лише найбільш загальні відомості про її структуру та функції. Для більш детального дослідження цих характеристик треба отримувати солюбілізовану форму ферменту.

Доступність солюбілізованої форми даного ферменту надала можливість визначення первинної структури молекули Са2+, Mg2+- АТРази, що дало змогу остаточного докорінного аналізу всіх його властивостей.

Вперше повна амінокислотна послідовність Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран клітин людини була встановлена в 1988 році. Для аналізу нуклеотидної послідовності було використано ген ферменту з сДНК банку тератокарциноми прямої кишки людини. Закодована послідовність складалась з 1220 амінокислотних залишків, що утворюють поліпептид молекулярною вагою 134 683 Да.

В будові ферменту були знайдені великі ділянки структурної подібності з іншими іонтранспортуючими Е1-Е2-АТРазами. До таких ділянок відносяться : 1) пептидна ділянка навколо амінокислотного залишку Asp-475, який фосфорилюється під час реакційного циклу; 2) FITC (АТР)- зв’язуюча ділянка; 3) пептидна ділянка, що розміщена між двома попередніми, яка забезпечує їх просторове зближення та ін. Наявність цих гомологічних та висококонсервативних ділянок в структурі Е1-Е2-АТРаз, напевно, обумовлено їх участю у найважливіших та загальних для всіх АТРаз етапах функціонування.

Молекула містить 10 трансмембранних сегментів, що з’єднані на зовнішньоклітинній поверхні плазматичної мембрани досить короткими петлями. На внутрішньоклітинному боці плазматичної мембрани фермент утворює якнайменше дві довгі гідрофільні петлі (між другим та третім, четвертим та п’ятим гіфдрофобними сегментами). До складу другої петлі входять АТР-фосфорилюємий та АТР зв’язуючий сегменти каталітичного ферментативного центру. Функціональна роль першої петлі поки що не з’ясована. По аналогії з іншими Е1-Е2-АТРазами вона може брати участь у спряженні процесів транслокації катіонів та гідролізу АТР. Слід зазначити, що до складу цієї петлі входить також суто специфічний для Са2+, Mg2+- АТРази фрагмент, який напевно є регуляторним центром ферменту, що є чутливим до фосфоліпідів.

В середину клітини також експоновані N- та C - кінцеві ділянки Са2+, Mg2+- АТРази. Функціональна роль N-кінцевого сегменту остаточно не з’ясована, але наявність в ній великої кількості негативно заряджених амінокислотних залишків дає підстави вважати, що він бере участь у процесі безпосереднього зв’язування з іонами Са2+. С-кінцевий сегмент без сумніву є регуляторним, оскільки тут розташовані кальмодулінзв’язуюча аутоінгібіторна ділянка, сегмент регуляторного фосфорилювання ферменту сАМР-залежною протеїнкіназою. Області навколо кальмодулінзв’язуючої ділянки білка також багаті на від’ємно заряджені амінокислотні залишки, що дає підставу розглядати їх в якості центрів зв’язування та транслокації катіонів.

В 1988 році була висунута гіпотеза про існування декількох ізоформ Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран при співставленні даних про первинну структуру ферменту, отриманих за допомогою методів генної інженерії та білкової хімії. Було показано, що Са2+, Mg2+- АТРаза плазматичних мембран тератокарциноми людини (hPMCA 1) відрізняється за будовою від Са2+, Mg2+- АТРази мембран еритроцитів людини. З 184 амінокислотних залишків, що входять до складу структурно охарактеризованих пептидних фрагментів Са2+, Mg2+- АТРази еритроцитів, лише 158 залишків були ідентичні відповідним амінокислотним залишкам Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран тератокарциноми .

Пызныше Шал та Гріб описали три різні ізоформи Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран з бібліотеки сДНК мозку щурів: rPMCA 1 та rPMCA 2 (rPMCA 3). Всі три ізоформи кодувались окремими генами. Одна з ізоформ Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран клітин мозку щурів (rPMCA 1) складалась з 1176 амінокислотних залишків та мала молекулярну вагу 129500 Да. Її перші 1117 амінокислотних залишків на 99 % були ідентичні трохи раніше описаній ізоформі Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран тератокарциноми прямої кишки людини (hPMCA 1). Аналіз амінокислотних послідовностей дозволив зробити висновок про те, що обидві ізоформи є продуктами одного гену, а розбіжності в структурі С-кінцевих послідовностей є результатом альтернативного сплайсингу відповідних мРНК. Аналогічно було доведено, що ізоформи hPMCA 2 тератокарциноми прямої кишки людини та rPMCA 2 клітин мозку щурів та відповідні ізоформи hPMCA 3 клітин слизової оболонки кишечнику та rPMCA 3 клітин мозку щурів також є продуктами експресії окремих структурних генів.

Слід зазначити, що при скринингу бібліотеки сДНК з мозку бика були знайдені фрагменти структурного гену ще однієї ізоформи Са2+, Mg2+- АТРази. ЇЇ структура досить істотно відрізняється від структури раніше описаних ізоформ, що є підстави говорити про існування четвертого структурного гену Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран.

За допомогою Northern blot аналізу було доведено, що експресія PMCA 1-4 генів є органозалежною: так, продукти транскрипції гену PMCA 1 характеризуються найширшою розповсюдженістю та представляють головну репрезентативну ізоформу Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран. PMCA 2 ізоформа Са2+, Mg2+- АТРази переважно виявляється в плазматичних мембранах клітин мозку, серця та печінки, PMCA 3 – в плазматичних мембранах клітин мозку та скелетних м’язів. PMCA 4 ізоформа може бути експресована в еритроцитах та інтестінальних клітинах.

Як вже було зазначено вище, первинні транскрипти кожного з генів можуть піддаватись альтернативному сплайсингу на 3’-кінці нуклеотидної послідовності. Існування великої різноманітності білкових продуктів гену PMCA 1 пояснюється виключенням, включенням або частковим включенням 3’-кінцевого екзону у нуклеотидну послідовність мРНК під час її дозрівання. Процес альтернативного сплайсингу може захоплювати ділянки РНК , які кодують функціонально важливі регуляторні центри ферменту, що знаходяться на С-кінці його поліпептидної послідовності. Зміна в структурній будові цих фрагментів є логічним поясненням існування форм Са2+, Mg2+- АТРаз, що відрізняються за чутливістю до кальмодуліну, ванадату, процесів фосфорилювання та ін.

Отже, існування різноманітних за своїми функціональними та регуляторними властивостями форм Са2+, Mg2+- АТРаз плазматичних мембран пояснюється багаточисельністю кодуючих генів Са2+, Mg2+- АТРаз та існування можливості альтернативного сплайсингу РНК матриць одного й того ж структурного гену. Однак досить логічного пояснення явищу поліморфізму для Са2+, Mg2+- АТРаз плазматичних мембран, їх тканинної специфічності, розбіжності в їх функціональних та регуляторних властивостях поки що не знайдено.



Каталітичні та кінетичні властивості очищеного ферменту.

\x00B8

\x00BA

Ae

E

I