Використані методи дослідження, Детальна інформація

Кінцеве заключення про наявність у досліджуваному матеріалі Trichomonas vaginalis робили тільки на основі виявлення типових простіших (овальні, круглі або неправильної форми, досить чітко виражений контур клітини, частіше ексцентрично розташоване овальне або кругле ядро з нечітким контуром, нерідко “піниста” цитоплазма [2, 3, 95].

”

”

на гонококову інфекцію проводили посіви на асцит-агар для виділення і ідентифікації культури гонококів [2, 3, 95, 283].

Діагностика вагінального кандідозу проводилася за допомогою мікроскопії нативних вологих мазків з 10% розчином гідрооксиду калію (для виявлення псевдо гіфів) і мазків, фарбованих 1% водним розчином метиленового синього, по Граму у модифікації Кореloff. У частини хворих з мікроскопічною картиною кандідозу по показах для підтвердження діагнозу проводили посіви на середовище Сабуро (рідке і агаризоване) [2, 3, 5, 95].

Мікоплазмова інфекція діагностувалася за допомогою комерційних наборів для РПІФ з специфічними моноклональними антитілами у відповідності з інструкцією (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м.Москва). Забір матеріалу проводили ложечкою Фолькмана з верхньої третини бокового склепіння піхви. А також визначали специфічні Ig G і Ig M до антигенів Mycoplasma hominis у сироватці крові пацієнток за допомогою комерційних наборів (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ). Також використовували “золотий” стандарт для виявлення Mycoplasma hominis виділення збудника у культурі на рідкому живильному середовищі з додаванням аргініну, рекомендованим харківським НДІ дерматології і венерології [2, 3, 95].

Діагностика уреаплазмової інфекції проводилася наступними методами. Виявлення специфічних антигенів Ureaplasma urealyticum РПІФ з специфічними моноклональними сироватками, використовуючи комерційний набір (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м. Москва). Матеріал для мазків відбирали з верхньої третини бокового склепіння піхви. Для виявлення Ig G до антигенів Ureaplasma urealyticum у сироватці крові пацієнток методом ІФА використовували комерційні набори (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ). Також використовували “золотий” стандарт для виявлення Ureaplasma urealyticum виділення збудника у культурі. Для цього використовували рідке живильне середовище з додаванням сечовини рекомендоване Харківським НДІ дерматології і венерології та, в основному, модифіковане середовище з лінкоміцином. Використання культурального дослідження було обов’язковим для верифікації діагнозу уреаплазмової інфекції [3, 95].

У процесі виконання роботи для виключення вірусної етіології захворювання використовувалися скринінгові методи вірусологічної діагностики. Лабораторна діагностика вірусної інфекції була орієнтована перш за все на визначення герпетичних і цитомегаловірусних уражень. Матеріалом для дослідження були мазки, взяті ложечкою Фолькмана з верхньої третини бокової стінки піхви з дотриманням правил асептики. При наявності уражень шкіри у області вульви і промежини у вигляді везикул, кондилом і ерозій для дослідження, використовували вміст везикул і зішкріби з підозрілих на вірусне ураження участків. Одержаний матеріал наносили на три знежирені предметні скельця, висушували на повітрі при кімнатній температурі і фіксували у 96% етиловому спирті або ацетоні упродовж 5 хвилин. Після чого проводили фарбування по Романовському-Гімзе (перший мазок), другий мазок обробляли специфічними моноклональними сироватками для виявлення антигенів Cytomegalovirus, а третій – специфічними моноклональними антитілами для виявлення антигенів Herpes simplex virus II type методом РНІФ, використовуючи комерційні набори (науково-виробнича фірма “ЛАБдиагностика”, м. Москва). Перший мазок досліджували під медичним світловим мікроскопом з імерсією (окуляр 10х, об’єктив 90х), а два інші під люмінесцентним мікроскопом Мікмед-2, варіант 11 (“Ломо”, м. Санкт-Петербург), використовуючи масляну імерсію (окуляр 7х, об’єктив Мі 90х, з фільтром забезпечуючим збудження світла з довжиною хвилі 490 нм і емісією з довжиною хвилі 520 нм.).

А також для діагностики вірусної інфекції використовували метод ІФА, виявляючи специфічні антитіла у сироватці крові пацієнток – IgM і Ig G до антигенів Cytomegalovirus і Herpes simplex virus II type, використовуючи комерційні набори для ІФА (фірма “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ) [2, 3, 95].

Проби для бактеріологічного дослідження відбирали в асептичних умовах, намагаючись попередити обсіменіння досліджуваних зразків супутньою аутомікрофлорою шкіри і інших локусів, що багато у чому визначало ефективність і достовірність бактеріологічної діагностики. Досліджуючим матеріалом був піхвовий вміст, який одержували під час гінекологічного огляду за допомогою стерильного дзеркала типу Куско або Сімса, використовуючи одноразові стерильні шприци, шпателі, ватні тампони або ложечки Фолькмана. Вказані зразки відбирали до початку лікування, через 7-10 днів після закінчення лікування і через 1 місяць по завершенню лікування.

Критеріями виключення пацієнток з дослідження було системне або місцеве використання антибактеріальних препаратів на протязі останніх двох тижнів (так як антибактеріальна терапія змінює мікробний пейзаж інфекційних вогнищ), вагінальний кандідоз, гонорея, трихомоніаз, хламідіоз, активна герпесвірусна та цитомегаловірусна інфекція.

Посів піхвового вмісту проводили на групу живильних середовищ, які дають можливість виявити максимальну видову різноманітність бактерій з використанням анаеробних технологій.

Система виділення і ідентифікації мікроорганізмів умовно включала два етапи: долабораторний (клінічний) і лабораторний. Долабораторний етап починався з моменту одержання матеріалу і завершувався доставкою проб у мікробіологічну лабораторію. Однією з умов транспортування зразків матеріалу був часовий інтервал, який не мав перевищувати 2-х годин. Для транспортування і накопичування одержаного матеріалу використовували цукровий, глюкозо-пептонний і серцево-мозковий бульйони, тіогліколеве середовище для контролю стерильності.

Всі етапи мікробіологічного дослідження виконувалися на базі бактеріологічної лабораторії об’єднаної клініко-діагностичної лабораторії обласного перинатального центру м. Івано-Франківська і бактеріологічної лабораторії кафедри мікробіології Івано-Франківської державної медичної академії.

Лабораторний етап починався з первинного посіву нативного матеріалу і закінчувався ідентифікацією виділених мікроорганізмів з визначенням у частини штамів антибіотикограм. У середньому для цього потрібно було від 4 до 15 діб.

Первинний висів досліджуваного матеріалу проводили на цукровий агар, 5% кров’яний агар, середовище Ендо, агар МРС, анаеробний гемагар із необхідними для культивування ОАБ добавками (збагачений геміном, менадіоном, твіном-80, гемолізованою кінською або людською кров’ю і вітаміном К). Живильні середовища готували самостійно у лабораторії, використовуючи сухі середовища.

У основу схем і методів ідентифікації всіх виділених культур та таксономічне положення бактерій визначали у відповідності з даними “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” [173, 174 , 175].

Окрім того частина штамів стафілококів і стрептококів ідентифікована за допомогою слайд тестів (“Difco», США; “bioMerieux”, Франція), ЛБ за допомогою “Системи індикаторних папірців для ідентифікації лактобацил” (СІП-Л) (Нижньо-Новгородський науково-дослідний інститут епідеміології і мікробіології, Росія).

Аналіз одержаних результатів починали з бактеріоскопії нативного матеріалу. Фарбування препаратів проводили по методу Грама у модифікації Kopeloff N. [159]. При мікроскопії враховували грамприналежність, морфологію мікроорганізмів, інтенсивність і тип фагоцитозу. Потім ці дані співставляли з даними, одержаними при вивченні вирослих колоній.

Анаеробні культури випробовували на аеротолерантність – здатність до росту у мікроаерофільних або аеробних умовах. При позитивному результаті цього тесту культуру відносили до ФАБ або мікроаерофілів, при відсутності росту – до ОАБ.

Ідентифікація мікроорганізмів проводилася за їх культуральними, біохімічними, морфологічними ознаками і використанням діагностичних дисків з ванкоміцином, канаміцином, пеніциліном, неоміцином, еритроміцином і деяких інших.

Вивчення чутливості до антибактеріальних препаратів проводили методом дифузії в агарі з використанням стандартних дисків. У випадку відсутності стандартних дисків до деяких препаратів, зокрема до похідних 5-нітроімідазолу (тінідазол, орнідазол), використовували метод двохкратних розведень у рідкому живильному середовищі.

Вивчення культуральних і морфологічних характеристик бактеріальних культур проводилося з використанням світлової, темнопольної, фазово-контрастної, стереоскопічної і люмінесцентної мікроскопії.

Виділення Gardnerella vaginalis проводили в атмосфері вуглекислого газу на анаеробному кров’яному агарі з додавання гентаміцину сульфату, налідіксової кислоти і амфотерицину В в адекватних пропорціях [159].

Gardnerella vaginalis ідентифікували як колонії з характерним бета-гемолізом і морфологією. При мікроскопії виявляли грамнегативні або грамваріабельні короткі, палички. Реакція на каталазу і оксидазу від’ємна, характерна антибактеріальна чутливість (стійкі до сульфаніламіду і чутливі до бацитрацину, з ознаками ферментації крохмалу, інгібіція 3% розчином перекису водню, від’ємна каталазна реакція, гідроліз гіпурата). Колонії Gardnerella vaginalis маленькі, рівні, повні.

Попередня ідентифікація проводилася у відповідності з наступними критеріями:

1)оцінка морфології колоній – колонії маленькі, сірі і випуклі з полем гемолізу або без нього;

2)забарвлення по Граму – на мазках з середовища були одержані грам - негативні і грамваріабельні поліморфні палички з заокругленим кінцем. Вони розташовані поодиноко або маленькими групами;

3)біохімічна ідентифікація – проводили посіви підозрілих колоній на крохмальний агар. Виросші колонії тестували на інгібування 3% розчином перекису водню і утворення каталази. Звертали увагу на бета-гемоліз. Для визначення чутливості використовували метод дисків з сульфаніламідом, бацитрацином [74, 159].

Кількісний аналіз мікрофлори піхви проводили як для аеробних і ФАБ, так і для ОАБ. Для кількісного визначення аеробних і ФАБ використовували метод секторальних посівів за способом Gould. Суть метода полягає у наступному: забір матеріалу проводили ватним тампоном, який потім вміщували у пробірку з 5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, добре перемішували і проводили посів на кров’яний агар бактеріологічною петлею на 1-й сектор чашки Петрі (30-40 штрихів).Після цього петлю пропалюють і виконують 4 штрихових посіви з 1-го сектору у 2-й, аналогічним чином із 2-го сектору в 3-ій, а з 3-го в 4-й, пропалюючи петлю після пересіву з кожного сектору. Чашки інкубують при температурі 37оС 18-24 години, після чого підраховують число колоній, які виросли в секторах. Кількість бактерій у 1 мл піхвового вмісту визначають по таблиці і результат перемножували на 5 [74, 159, 160].